用高速逆流色谱分离制备白果内酯的过程

 

 

 2 实验方法

 

 2．1 对照品溶液的配制 分别精密称取银杏内酯 A，B，c和白果内酯对照品(干燥至恒重)适量，加甲 醇配成浓度各为1 rng／ml的对照品溶液。

 

 2．2 样品溶液的制备 取一根20mm×360mm 的 玻璃柱，称取经400℃ 下活化5h的酸性氧化铝适 量，按湿法装柱，称取银杏叶粗提物0 5g，用1Oml 甲醇溶解，上柱，用60ml甲醇洗脱，洗脱液挥发至 干。配制氯仿 甲醇一水(4：3：2)的两相系统，上下两 相各取0 25ml，用此溶剂溶解经柱层析后的挥干 物，配制成浓度约为lg／ml的样品液(以粗提物计)。

 

 2．3 薄层层析条件以银杏内酯A，B，c和白果内 酯对照品溶液为标准对照，取4％醋酸钠改性的硅 胶H 薄层板，以甲苯一乙酸乙酯一丙酮一甲醇(4：6： 2 7 0．8)为展开剂，上行展开local，晾干，以醋酐熏 20min，160℃下烘30min，然后在紫外灯( =365nm) 下观察荧光，各内酯斑点呈不同程度的亮黄色。

 

 2 4 高速逆流色谱条件 采用氯仿一甲醇．水(4：3： 2)的溶剂系统，待两相溶剂充分混合后，临用前将其 分开，在室温下，下相作流动相，上相作固定相，采用 2．0 ml／min的流速，由首端向尾端洗脱，主机正转， 转速为800r／min，固定相保留值为78％，进样2．0 ml，定时收集馏分，用TLC鉴定。实验结束时，用氮 气将固定相由首端向尾端推出，并依次用乙醇 30ml，水40ml冲洗.

 

 结 果

 

 1 分离结果分析

 

 由于银杏萜类内酯的紫外吸收较弱+因此在色 谱图上未见有明显的吸收峰，我们采用TLC的方法 对实验结果进行分析。从进样后25rain开始，每隔 5rain收集馏分，经浓缩后与银杏萜类内酯对照品分 别点样于薄层板上，按薄层层析条件展开、显色，发 现50rain以后收集的馏分出现银杏萜类内酯。因 此，从进样后50rain开始，每隔4min收集馏分，依次 记为1，2，??共18份(运行120min)，将收集的馏 分浓缩后点样于薄层板上，经展开、显色，与对照品 比较，结果见图l。从图1可见：86～90，90～94min (第10，11号斑点)，2个馏分只显1个斑点，其Rf 值与白果内酯(BB)一致；50～66min(第1～4号斑 点)收集的馏份存在2个斑点，其Rf值与银杏内酯 A(GA)，银杏内酯B(GB)相似；66～86 min收集的 馏分，与BB，银杏内酯c(GC)的Rf值对应位置有 较弱的荧光斑点，且同时存在其他杂质；94min以后收集的馏分(第12～18斑点)呈复杂的混合斑点，Rf 值偏小。

 

 2 分离鉴定

 

 经TLC鉴定馏出物，我们专门收集86～94min 的馏分，并经多次进样，合并馏出物，挥干，对馏出物 进行MS，IR光谱分析，MS：m／z：327(M)，270(M一 56)，196(M一129)，178，129，57(基峰)，44；IR一 (cm )：3450(羟基)，1800，1780，1760(r_内酯)。 并经液相色谱分析，为单一峰，经与标准图谱对 照确认为白果内酯。

 

 讨 论

 

 1 薄层层析展开剂的选择

 

 按文献报道_] 的展开系统，分别进行考察后 发现，其分离效果不令人满意，我们对此作了改进。 采用甲苯一乙酸乙酯一丙酮一甲醇(6：4：2 7：0．8)为展 开剂，其溶剂强度为3．99，分离效果好，斑点清晰集 中，其Rf值GC，GB，GA，BB分别为0 28，0 46， 0．54，0．65。

 

 2 溶剂系统的选择

 

 2 1 溶剂配比、分层时间及两相比的测定分别按 不同的配比配制3种溶剂系统，在容积为lOml刻度 试管中剧烈振荡1min，使溶液充分混合，然后立即 垂直静置，记录溶剂从静置到分为澄清两层的时间， 同时记录上下两相的比值，结果见表1。

 

 

 

 2．2 分配比的测定 用60ml的分液漏斗，将上述3种溶剂系统配制20～30ml，分别取上下相各2ml然后再将对应的两相等体积混合于10ml试管中，分别加人约0 lg的银杏叶粗提物 充分振荡，使样品在两相中*溶解，然后分别取3个体系中上下相的粗提物溶液点样于TLC板上，按TLC条件展开观察，我们估算出银杏叶萜类内酯在氯仿．甲醇水(4：3：2)体系中的分配比zui接近1，其次为氯仿一正丙醇．甲醇一水(9：1：10 5：8)体系；在四氯化碳一甲醇．水(5：4：1)体系中，下相基本没有银杏叶萜类内酯存在。

 

 在用HSCCC进行分离时，溶剂系统要求分层速度快，两相体积大体相等，分配比一般选择0.3

 

 3 操作参数的考察

 

 对确定的溶剂系统分别采用两种条件作考察，由首端向尾端洗脱．主机正转作为溶剂系统的上机操作条件，发现在转速恒定的条件下，以下相作流动相，上相作固定相时其保留值可达78％。同时发现增大转速或减步流速，都可以降低或消除固定相的带出现象；但流速过低时，分离时间延长，分离效率降低；而长期高速旋转，产生的热量将影响分离的稳定性。

 

 4 样品的制备对分离的影响

 

 由于样品不能单独溶于上相或下相，而采用等体积的上下两相配制样品溶液，可*溶解样品，因此我们采用等体积的上下两相混合液溶解样品。

 

 5 检测手段

 

 银杏萜类内酯的检测方法多采用示差折光检测器、蒸发激光散射检测器，由于仪器设备要求高，因此很难推广。我们采用TLC为检测手段，对馏分进行定性分析，能较准确反映馏分的组成，对实验结果进行分析鉴别，在此条件下，准确分离制得雎单体。